GST pull down

GST pull down（GST融合蛋白沉降技術）是體外檢測蛋白相互作用的常用方法，可驗證已知蛋白之間的互作，也可用于篩選與已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，簡單易行。

GST pull down實驗原理

GST pull down的主要原理是利用DNA重組技術將已知蛋白與GST融合，而融合蛋白通過GST與固化在載體上的GTH（谷胱甘肽）親和結合。簡單來說，我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定時間，然后洗去未結合的蛋白，煮沸beads進行SDS-PAGE電泳。通過Western blot檢測結果，我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應的條帶，即表明了a蛋白和b蛋白因發生相互作用而被GST-a pull down（GST對照只顯示一個條帶）。

GST pull down實驗步驟

GST-a融合蛋白的制備

1．GST-a融合蛋白的表達

(1)將目的蛋白與GST的重組質粒轉化到BL21菌株中；

(2)挑取單克隆到含有5ml LB培養基（加入5ul氨芐）的10ml試管里，37℃恒溫振蕩培養箱中培養過夜；

(3)將培養菌液轉移到含有500ml LB（含500ul氨芐）的1L錐形瓶中，37℃，200rpm培養數小時；

(4)測定OD600值，當OD600達到0.6左右時，加入適當濃度的IPTG，在20℃，200rpm條件下培養10-16h（通常需要進行預實驗以確定最佳IPTG濃度、誘導溫度和時間）；

(5)誘導適當時間后，將菌液分次倒入50ml離心管中，4℃ 4000rpm離心10分鐘，然后棄去上清，收集管底菌體，如暫時不用，可將菌體保存于-80℃冰箱中；

(6)先加入少量PBS于離心管中，離心5-10min后棄去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS的量加入相應的PBS，渦旋振蕩，使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中；

(7)把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進行破碎。每次超聲破碎20s，間隔30s（破碎時間、破碎次數和間隔時間視具體情況而定），經過適當時間超聲后，溶液會顯得澄清；

(8)將超聲后的溶液4℃ 4000rpm離心10分鐘，上清液轉移至新的離心管中，-80℃保存備用。

2．GST-a融合蛋白的純化

(1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B，4℃搖床上緩慢搖動30~60min;

(2)4℃，4000rpm離心5min，棄去上清，該Sepharose上結合了GST-a融合蛋白；

(3)加入200ul預冷的PBS溶液，輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次，4℃，4000rpm離心5min，棄去上清，重復此步驟3次；

(4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體，但注意不要吸走珠子，即可獲得結合GST-a的Sepharose。

b蛋白的制備

b蛋白可融合His標簽進行原核表達，也可融合Flag/HA/Myc等標簽進行真核表達。

體外蛋白的結合

(1)將結合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中，加入20ul含有b蛋白的溶液，同時采用結合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對照，在搖床上晃動4-8h（4℃）；

(2)4℃，4000rpm離心5min，棄去上清液；

(3)沿壁加入200ul預冷的緩沖液對Sepharose進行洗滌，

(4)4℃，4000rpm離心5min，棄上清，該步驟重復3次；

(5)吸干Sepharose上面的液體后，加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5min，放入-20℃冰箱備用；

(6)通過SDS-PAGE和Western blot進行檢測

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