<source id="e8sv9"></source>

    1. <i id="e8sv9"><bdo id="e8sv9"></bdo></i>
    2. <b id="e8sv9"></b>

        在線客服
        在線客服
        服務時間:8:30~17:30
        客服熱線
        400-1500-535
        客服服務熱線
        關注微信

        微信

        原代細胞培養
        GST pull down

        時間:2021-03-05 瀏覽:1376次

        GST pull down

        GST pull downGST融合蛋白沉降技術)是體外檢測蛋白相互作用的常用方法,可驗證已知蛋白之間的互作,也可用于篩選與已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便,簡單易行。

        GST pull down實驗原理

        GST pull down的主要原理是利用DNA重組技術將已知蛋白與GST融合,而融合蛋白通過GST與固化在載體上的GTH(谷胱甘肽)親和結合。簡單來說,我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作,將純化的融合GSTa蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結合GSTSephrose 4B beads混合在一起孵育一定時間,然后洗去未結合的蛋白,煮沸beads進行SDS-PAGE電泳。通過Western blot檢測結果,我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應的條帶,即表明了a蛋白和b蛋白因發生相互作用而被GST-a pull downGST對照只顯示一個條帶)。


        GST pull down實驗步驟

        GST-a融合蛋白的制備

        1GST-a融合蛋白的表達

        (1)將目的蛋白與GST的重組質粒轉化到BL21菌株中;

        (2)挑取單克隆到含有5ml LB培養基(加入5ul氨芐)的10ml試管里,37℃恒溫振蕩培養箱中培養過夜;

        (3)將培養菌液轉移到含有500ml LB(含500ul氨芐)的1L錐形瓶中,37℃,200rpm培養數小時;

        (4)測定OD600值,當OD600達到0.6左右時,加入適當濃度的IPTG,在20℃,200rpm條件下培養10-16h(通常需要進行預實驗以確定最佳IPTG濃度、誘導溫度和時間);

        (5)誘導適當時間后,將菌液分次倒入50ml離心管中,44000rpm離心10分鐘,然后棄去上清,收集管底菌體,如暫時不用,可將菌體保存于-80℃冰箱中;

        (6)先加入少量PBS于離心管中,離心5-10min后棄去上清,再按每10ml菌液沉淀1ml PBS的量加入相應的PBS,渦旋振蕩,使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中;

        (7)把混合菌體置于冰水浴中,用超聲儀進行破碎。每次超聲破碎20s,間隔30s(破碎時間、破碎次數和間隔時間視具體情況而定),經過適當時間超聲后,溶液會顯得澄清;

        (8)將超聲后的溶液44000rpm離心10分鐘,上清液轉移至新的離心管中,-80℃保存備用。

        2GST-a融合蛋白的純化

        (1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B,4℃搖床上緩慢搖動30~60min;

        (2)4℃,4000rpm離心5min,棄去上清,該Sepharose上結合了GST-a融合蛋白;

        (3)加入200ul預冷的PBS溶液,輕晃懸浮珠子,將Sepharose洗滌一次,4℃,4000rpm離心5min,棄去上清,重復此步驟3次;

        (4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體,但注意不要吸走珠子,即可獲得結合GST-aSepharose。

        b蛋白的制備

        b蛋白可融合His標簽進行原核表達,也可融合Flag/HA/Myc等標簽進行真核表達。

        體外蛋白的結合

        (1)將結合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中,加入20ul含有b蛋白的溶液,同時采用結合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對照,在搖床上晃動4-8h4℃);

        (2)4℃,4000rpm離心5min,棄去上清液;

        (3)沿壁加入200ul預冷的緩沖液對Sepharose進行洗滌,

        (4)4℃,4000rpm離心5min,棄上清,該步驟重復3次;

        (5)吸干Sepharose上面的液體后,加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液,沸水浴5min,放入-20℃冰箱備用;

        (6)通過SDS-PAGEWestern blot進行檢測


        【一站式整體科研服務,成就更高水平的科研成果】

        標書基金實驗咨詢       表觀遺傳組學分析

        課題實驗結題指導       細胞分子功能驗證

        實驗培訓文章潤色       動物模型裸鼠成瘤

        臨床檢測科研轉化       病理染色分子互作
        麟美生物主營業務包括實驗動物模型建立、分子生物學、載體構建、細胞轉染、基因治療實驗、細胞功能驗證、基因敲出/入、原代培養、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立等多項科研技術服務,并建立了涵蓋實驗設計、項目實施、結果整理、數據分析及策略咨詢等一站式的科研服務體系并提供全方位科研方案。

        合作流程:

        全國免費電話:400-1500-535

        公司郵箱:3405768204@qq.com

        官方網址:www.jshotarot.com

        公司地址:合肥市高新區天達路2號安徽大學科技園創新樓5層



        国产麻豆精品无码专区网站_中文毛片无遮挡高潮免5费_日韩av激情中文在线观看_AV无码精品1区2区3区

          <source id="e8sv9"></source>

        1. <i id="e8sv9"><bdo id="e8sv9"></bdo></i>
        2. <b id="e8sv9"></b>