細胞周期

細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等。

一、BrdU法

1、原理

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

細胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小時）

2、儀器、用品與試劑 

2.1、儀器、用品：同常規細胞培養

2.2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

3、操作步驟 

3.1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。

3.2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3.3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

3.4、常規染色體制片（見第三部分：染色體技術）。

3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

3.7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

3.8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

3.9、計算：

2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H₂ O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

附：BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

二、PI染色檢測細胞周期

1、離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次。

2、加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定（4℃過夜一般隔天就進行檢測，如果想推遲幾天測，那就保存在-20℃，有資料說-20℃可以保存一個月，個人建議盡量在最短時間內檢測，有些實驗是在不同時間點上收細胞，這時我就等最后一次固定完了一塊測，基本上也多在一周內檢測完畢，沒有特地去比較保存時間對檢測結果的影響）。

3、細胞染色

離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分鐘（PI我是直接用PBS配成工作濃度，然后加入細胞沉淀混勻，RNA酶現加，但有時不加發現對實驗結果也沒太大的影響） 。

4、流式分析

以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數2-3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

分析時，使用FL2-w和FL2-A顯示，去除聯體細胞。

細胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期),而如果分析時細胞窗口沒設置好，可能在最前面還有細胞碎片峰。

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