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        原代細胞培養
        細胞周期檢測

        時間:2021-03-05 瀏覽:2124次

        細胞周期

        細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多,有同位素標記法、細胞計數法等。


        一、BrdU

        1、原理

        BrdU5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養基后,可做為細胞DNA復制的原料,經過兩個細胞周期后,細胞中兩條單鏈均含BrdUDNA將占l/2,反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的值。

        細胞周期(Tc=48/{M1 2M2 3M3 4M4 /100}(小時)

        2、儀器、用品與試劑 

        2.1、儀器、用品:同常規細胞培養

        2.2、試劑:BrdU1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC

        3、操作步驟 

        3.1、細胞生長至指數期時,向培養液中加入BrdU,使最終濃度為10μg/ml。

        3.2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。

        3.3、48小時后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

        3.4、常規染色體制片(見第三部分:染色體技術)。

        3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

        3.6、棄去2×SSC液,流水沖洗。

        3.7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。

        3.8、鏡檢100個分裂相,計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

        3.9、計算:

        2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉·2H2 O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。

        附:BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。


        二、PI染色檢測細胞周期

        1、離心收集細胞,棄上清,用預冷PBS洗細胞兩次。

        2、加入預冷70%乙醇,于4℃固定過夜,或-20℃長期固定(4℃過夜一般隔天就進行檢測,如果想推遲幾天測,那就保存在-20℃,有資料說-20℃可以保存一個月,個人建議盡量在最短時間內檢測,有些實驗是在不同時間點上收細胞,這時我就等最后一次固定完了一塊測,基本上也多在一周內檢測完畢,沒有特地去比較保存時間對檢測結果的影響)。

        3、細胞染色

        離心收集細胞,以1mLPBS洗細胞一次,加入500uLPBS50ug/mL溴化乙錠(PI),100ug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100, 4℃避光孵育30分鐘(PI我是直接用PBS配成工作濃度,然后加入細胞沉淀混勻,RNA酶現加,但有時不加發現對實驗結果也沒太大的影響) 。

        4、流式分析

        以標準程序用流式細胞儀檢測,一般計數2-3萬個細胞,結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

        分析時,使用FL2-wFL2-A顯示,去除聯體細胞。

        細胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份,如果有凋亡,在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0),而如果分析時細胞窗口沒設置好,可能在最前面還有細胞碎片峰。


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