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        原代細胞培養
        細胞凋亡檢測

        時間:2021-03-05 瀏覽:1456次

        細胞凋亡

        細胞凋亡或稱程序性細胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是細胞的生命現象之一,它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關,自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死,它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變,包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞,磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine, PS)位于細胞膜的內側,但在凋亡的細胞,PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36KDCa2+ 依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)標記,以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。


        一、實驗步驟:

        1.  凋亡細胞的制備

        2.  200 μl細胞懸液加入1 mlPBS,輕輕震蕩使細胞懸浮,1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘,棄上清。

        3.  重復步驟2兩次。

        4.  將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。

        5.  加入10 μl Annexin V-FITC,輕輕混勻,避光室溫反應15 分鐘或4 ℃反應30 分鐘。

        6.  加入300 μl標記緩沖液,立即上機(流式細胞儀)檢測。


        二、注意事項:

        1.  整個操作過程動作要盡量輕柔,切勿用力吹打細胞,盡量在4 ℃下操作。

        2.  反應完畢后要盡快檢測,因為細胞凋亡是一個動態的過程,反應一小時后熒光強度就開始衰變。

        3.  Annexin V-FITC是光敏物質,在操作時要注意避光。


        三、實驗結果

        用熒光顯微鏡觀察,凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環。PS轉移到細胞膜外不是調亡所特有的,也可發生在細胞壞死中。以FITC標記的Annexin V, 可以同時結合使用PI(碘化丙啶)拒染法,用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。


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