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        原代細胞培養
        染色質免疫共沉淀(CHIP)

        時間:2021-03-05 瀏覽:1638次

        染色質免疫共沉淀

        染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具,通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與新一代測序技術相結合的ChIP-Seq技術,能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。


        一、ChIP實驗操作流程

        1.樣品準備與交聯

        細胞收集后,用1%的formaldehyde處理細胞,交聯核酸與DNA結合蛋白;

        2.超聲打斷染色質

        裂解細胞,用超聲波將染色質超聲破碎成200-1000bp片斷;將片段分為兩份,一份用于免疫共沉淀,一份用于對照。


           圖1染色質免疫共沉淀實驗流程                                              圖2 超聲破碎后DNA電泳圖(lane2)

        3.免疫共沉淀(IP)

        取B步驟所得一份片斷與ChIP特異抗體結合進行免疫共沉淀,利用免疫磁珠法富集抗體復合物。

        4.解交聯及純化DNA

        將富集的DNA/蛋白復合物解交聯釋放DNA片段,并進行純化(IP DNA);B步驟所得用于對照(Input DNA)的片斷作不進行IP實驗,但也要解交聯并純化。

        5.DNA段PCR擴增

        針對ChIP DNA, Input DNA及對照DNA的目的片段設計特異性引物并進行熒光定量PCR擴增。

        6.結果分析

        %Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%

        Fold Enrichment = [%(ChIP/Input)] / [%( Negative control/Input)]


        應用領域:

        ?  判斷DNA鏈的某一特定位置組蛋白修飾的類型

        ?  精確定位RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點

        ?  組蛋白共價修飾與基因表達的關系的研究

        ?  轉錄因子結合位點和功能研究


        產品優勢:

        ?  檢測覆蓋范圍廣:全基因組范圍內掃描目標區域;

        ?  檢測分辨率高:更利于精確定位目標區域;

        ?  樣本需要量低:需要的免疫沉淀后的DNA量可低至5-10ng;

        ?  可靠性好:避免了非特異性雜交,背景低;

        ?  性價比高:花費較少即可檢測全基因組,獲取準確豐富的信息。


        1.基本信息分析

        按照標準過濾原則對將raw data過濾成clean data;

        raw data及clean data的數據量及Q20、Q30統計;

        raw data及clean data測序質量分布圖,GC/AT含量分布圖,duplicate rate統計。


        2.標準信息分析

        比對到參考基因組并統計比對結果(需提供參考基因組信息);

        Peak calling得出Peak region report(CSC bedformat file);

        去除multiple  identical序列;

        確定轉錄結合位點和組蛋白標記;

        Peak相關基因的GO注釋分析;

        多個樣本間peak及相關基因的差異分析。


        3.高級信息分析

        根據客戶的具體研究目的所開展的深入分析。


        樣品要求:

        1. 樣品類型:ChIP-DNA;

        2. 樣品濃度:≥10 ng/μl;

        3. 樣品總量:≥100 ng;單次實驗用量為30ng時實驗的可重復性較好,因此請盡可能提供較多的樣品;若單次ChIP后DNA量不夠,建議將2~3次ChIP的DNA合并在一起;

        4. 樣品純度:OD260/280為1.8~2.2;

        5.DNA片段大?。悍植荚?00~500bp范圍,且主要片段在~250bp(清晰的電泳圖或2100檢測結果)。



        【一站式整體科研服務,成就更高水平的科研成果】

        標書基金實驗咨詢       表觀遺傳組學分析

        課題實驗結題指導       細胞分子功能驗證

        實驗培訓文章潤色       動物模型裸鼠成瘤

        臨床檢測科研轉化       病理染色分子互作
        麟美生物主營業務包括實驗動物模型建立、分子生物學、載體構建、細胞轉染、基因治療實驗、細胞功能驗證、基因敲出/入、原代培養、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立等多項科研技術服務,并建立了涵蓋實驗設計、項目實施、結果整理、數據分析及策略咨詢等一站式的科研服務體系并提供全方位科研方案。

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