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免疫共沉淀（Co-IP）

時間：2021-03-05 瀏覽：1810次

免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象開發出來的方法。

其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于Agarose珠上的Protein A或G，若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein A或G”，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。

然后經免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的，符合體內實際情況，得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

免疫共沉淀優點

（1）相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態；

（2）蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響；

（3）可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。

免疫共沉淀缺點

（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；

（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；

（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

免疫共沉淀實驗流程

（1）轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白免疫共沉淀酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C，最大轉速離心30 min后取上清。

（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜。

（3）取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min。

（4）將預處理過的10 μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。

（5）免疫沉淀反應后，在4°C 以3 000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml 裂解緩沖液洗3~4次；最后加入15 μl 的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。

（6）SDS-PAGE， Western blotting或質譜儀分析。

注意的問題：

（1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2%SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。

（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

（3）使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

免疫共沉淀注意的問題

（1）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生。

（2）要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。

（3）確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。

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