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        原代細胞培養
        免疫共沉淀(Co-IP)

        時間:2021-03-05 瀏覽:1810次

        免疫共沉淀

        免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原抗體的特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象開發出來的方法。

        其基本原理是,在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結合的結合于Agarose珠上的Protein A或G,若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白,就可以形成這樣一種復合物:“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein A或G”,經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,復合物又被分開。

        然后經免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的,符合體內實際情況,得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。




        免疫共沉淀優點
        (1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;
        (2)蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;
        (3)可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。
        免疫共沉淀缺點
        (1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;
        (2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;
        (3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。
        免疫共沉淀實驗流程
        (1)轉染后24-48 h 可收獲細胞,加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白免疫共沉淀酶抑制劑),冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C, 最大轉速離心30 min后取上清。
        (2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜。
        (3)取10 μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3 000 rpm離心3 min。
        (4)將預處理過的10 μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。
        (5)免疫沉淀反應后,在4°C 以3 000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 ml 裂解緩沖液洗3~4次;最后加入15 μl 的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘。

        (6)SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析。




        注意的問題:
        (1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。
        (2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用。
        (3)使用對照抗體:
        單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗
        兔多克隆抗體:正常兔IgG
        免疫共沉淀注意的問題
        (1)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生。
        (2) 要確??贵w的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。

        (3) 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。


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