
時間:2021-03-05 瀏覽:3509次
PCR
一、實驗原理
PCR 全稱聚合酶鏈式反應(英文:Polymerase chain reaction),是利用DNA雙鏈復制的原理,在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學技術,其特點是可以以微量的DNA為模板,快速擴增得到大量拷貝。原理是基于DNA 半保留復制與堿基互補配對原則,是在體外模擬DNA的天然復制過程,主要由‘變性-退火-延伸’這三個基本步驟構成,變性:DNA雙鏈在高溫條件(95℃)下解旋形成單鏈;退火:降低溫度可使引物結合到單鏈DNA上,DNA聚合酶結合到引物上;延伸:DNA 聚合酶在其最適反應溫度(72℃)開始沿著DNA鏈5'-3' 方向合成互補鏈。隨著PCR 的進行,生成的DNA本身將作為模板,從而啟動鏈式反應,原始DNA模板被指數擴增。
二、實驗試劑
Taq酶,M-MLV逆轉錄酶,dNTPs, DEPC處理水,雙蒸水
三、實驗儀器
電泳儀, PCR儀,高速離心機,移液器,電泳儀,電泳槽,紫外分析儀
四、操作步驟
1.cDNA的合成
逆轉錄體系的組成:
2.PCR擴增特異性片段
25ul PCR體系的組成:
五、實驗注意事項
整個操作始終注意避免RNA酶的污染;
PCR反應靈敏,注意避免試劑污染;
酶易失活,整個操作注意在冰上進行。
設立對照:陽性對照:陽性模板,陰性對照:陰性模板,試劑對照:除模板外的所有組分。
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