TUNEL

一、原理與意義：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯苯胺（DAB）產生深棕色反應，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。

本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、器材與試劑

1、器材：光學顯微鏡及其成像系統、搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的移液器及槍頭等。

2、試劑：試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標記的dUTP、標記streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H₂O₂ 20×；

3、自備試劑：

（1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；

（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；

（3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。

（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；

（5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA；

（6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml）；

（7）DAB工作液（臨用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）

（8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀釋貯存液1 mg/ml）。

（9）另外，雙蒸水、無菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、蘇木素。

三、實驗步驟

1、脫蠟：用二甲苯浸洗5 min×2次；

2、水化：用梯度乙醇（100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min）；

3、浸洗：0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min；

4、固定：浸入4%多聚甲醛15 min；

5、浸洗：PBS 5 min×2次；

6、細胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15（10~30）min RT；

7、浸洗：PBS洗5 min；

8、固定：浸入4%多聚甲醛5 min；

9、浸洗：PBS 5 min×2次；

10、平衡：加100 ul平衡液，濕盒平衡10（5~10）min；

11、制備TUNEL反應混合液：處理組用1ul rTdT+1ul生物素標記的dUTP+98 ul平衡液混勻；而陰性對照組不加rTdT，改為三蒸水；陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min，后面步驟從第10步開始。

12、標記反應：加100ul TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。

13、終止反應：浸入2×SSC 15 min；

14、浸洗：PBS 5 min×3次；

15、封閉POD：浸入0.3%H2O2 15 min；

16、浸洗：PBS 5 min×3次；

17、酶標反應：加100 ul streptavidin標記HRP（按1：500 PBS稀釋）30 min；

18、浸洗：PBS 5 min×3次；

19、DAB顯色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水）10 min左右，鏡下出現淺棕色背景時。

20、用去離子水沖洗幾次；

21、用蘇木素復染，3 s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水（50、70、85、95、100、100%各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。

22、加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照?？山Y合凋亡細胞形態特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）。

四、注意事項

1、結果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA片斷，從而引起假陽性結果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應，進而產生假陰性結果。

2、初次檢測細胞凋亡，最好設置陽性對照片。

3、血細胞含量高的組織，盡可能延長過氧化氫的滅活時間。

4、蘇木素的復染時間需要摸索。

5、每片所加試劑可調整，一般30~100 ul不等，但也要防止液體揮發而干片，且反應均在放置濕盒內。

結果展示：