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        原代細胞培養
        TUNEL

        時間:2021-03-04 瀏覽:3159次

        TUNEL

        一、原理與意義:

        TUNELTdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況,其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA3’-OH末端,并與連接辣根過氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的鏈霉親和素streptavidin特異性結合,后者又與POD底物H2O2、二氨基聯苯胺(DAB)產生深棕色反應,特異準確地定位正在凋亡的細胞,因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞;由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3-OH形成,很少能夠被染色。

        本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細胞樣本(細胞涂片)在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價,以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

        二、器材與試劑

        1、器材:光學顯微鏡及其成像系統、搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的移液器及槍頭等。

        2、試劑:試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標記的dUTP、標記streptavidinHRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×;

        3、自備試劑:

        11×PBSpH 7.4,2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4),115℃×15 min;

        20.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水,115 ℃×15 min;

        34%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS65 ℃水箱中3 h多,再放入4 ℃保存。

        4DNase I buffer40 mM Tris-HCl pH 7.9+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2;

        5Proteinase K buffer100 mM Tris-HCl pH 8.0+50 mM EDTA;

        6DNase 1(原液1000 U/ml199DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml);

        7DAB工作液(臨用前配制,5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS

        820 μg/ml Proteinase K工作液(按1500稀釋貯存液1 mg/ml)。

        9)另外,雙蒸水、無菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(100、95、85、70、50%)、蘇木素。

        三、實驗步驟

        1、脫蠟:用二甲苯浸洗5 min×2次;

        2、水化:用梯度乙醇(100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min);

        3、浸洗:0.85%NaCl×5 min?PBS5 min;

        4、固定:浸入4%多聚甲醛15 min;

        5、浸洗:PBS 5 min×2次;

        6、細胞通透:用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織1510~30min RT;

        7、浸洗:PBS5 min;

        8、固定:浸入4%多聚甲醛5 min;

        9、浸洗:PBS 5 min×2次;

        10、平衡:加100 ul平衡液,濕盒平衡105~10min;

        11、制備TUNEL反應混合液:處理組用1ul rTdT+1ul生物素標記的dUTP+98 ul平衡液混勻;而陰性對照組不加rTdT,改為三蒸水;陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min,甩掉液體后再加100 ul DNase 110 U/ml)酶切10 min,用去離子水沖洗4次,PBS浸洗5 min,后面步驟從第10步開始。

        12、標記反應:加100ul TUNEL反應混合液于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。

        13、終止反應:浸入2×SSC 15 min;

        14、浸洗:PBS 5 min×3次;

        15、封閉POD:浸入0.3%H2O2 15 min;

        16、浸洗:PBS 5 min×3次;

        17、酶標反應:加100 ul streptavidin標記HRP(按1500 PBS稀釋)30 min;

        18、浸洗:PBS 5 min×3次;

        19、DAB顯色(避光):加100 ulDAB混合液(50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水)10 min左右,鏡下出現淺棕色背景時。

        20、用去離子水沖洗幾次;

        21、用蘇木素復染,3 s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水(50、70、85、95、100、100%1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。

        22、加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照??山Y合凋亡細胞形態特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現發泡現象,晚期出現凋亡小體,貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體)。

        四、注意事項

        1、結果分析時注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA片斷,從而引起假陽性結果;而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應,進而產生假陰性結果。

        2、初次檢測細胞凋亡,最好設置陽性對照片。

        3、血細胞含量高的組織,盡可能延長過氧化氫的滅活時間。

        4、蘇木素的復染時間需要摸索。

        5、每片所加試劑可調整,一般30~100 ul不等,但也要防止液體揮發而干片,且反應均在放置濕盒內。

        結果展示:




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        課題實驗結題指導       細胞分子功能驗證

        實驗培訓文章潤色       動物模型裸鼠成瘤

        臨床檢測科研轉化       病理染色分子互作


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