CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來自細菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。

目前，來自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結構簡單（5’-NGG-3’），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統。

通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作。

作為一種新的基因編輯技術，CRISPR/Cas9有以下特點和優勢：

1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才會對DNA進行剪切。

2、可實現對靶基因多個位點同時敲除。

3、實驗周期短，最快僅需2個月，節省大量時間和成本。

4、無物種限制。

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